1. Αποθετήριο Παραδοτέων Υποτρόφων Δράσεων ΕΣΠΑ Τριτοβάθμιας Εκπαίδευσης 2017-2023
2. Όλο το Αποθετήριο
3. Υποψήφιοι διδάκτορες

Τύπος:	Διδακτορική διατριβή
Τίτλος:	The organization of the fungal plasma membrane in the quiescent state
Εναλλακτικός τίτλος:	Η οργάνωση της κυτταρικής μεμβράνης των μυκήτων στην κατάσταση αδράνειας
Συγγραφέας:	[EL] Μεγαριώτη, Αμαλία[EN] Megarioti, Amalia
Επιβλέπων διατριβής:	[EL] Διαλλινάς, Γεώργιος[EN] Diallinas, George
Συμβουλευτική επιτροπή:	[EL] Γουρνάς, Χρήστος[EN] Gournas, Christos [EL] Σοφιανοπούλου, Βασιλική[EN] Sophianopoulou, Vassiliki
Μέλος εξεταστικής επιτροπής:	[EL] Κουβέλης, Βασίλειος[EN] Kouvelis, Vasileios [EL] Αλεξόπουλος, Χαράλαμπος[EN] Alexopoulos, Charalampos [EL] Χατζηνικολάου, Δημήτριος[EN] Hatzinikolaou, Dimitris [DE] Wedlich - Söldner, Roland
Ημερομηνία:	2023
Περίληψη:	The plasma membrane performs a plethora of physiological processes, the coordination of which requires organization into specialized domains. In Saccharomyces cerevisiae several domains have been identified, with one the most studied being the Membrane Compartment occupied by the arginine transporter Can1 (MCC). ΜCCs colocalize subcortically with a protein scaffold termed ‘eisosome’. Previous studies have reported that eisosomes act as transporter-reservoir domains upon transient nutrient starvation. However, the roles of eisosomes upon long-term starvation remain unknown. Importantly, upon long-term starvation quiescent cells are formed. In a closed culture of S. cerevisiae, following glucose depletion and during the respiratory metabolism of ethanol, yeasts differentiate into quiescent and senescent populations. Quiescent cells are resistant to stress, show long-term survival and are respiratory competent. On the contrary, senescent cells are aged, apoptotic and respiration deficient. Quiescence, a reversible, non-proliferating state, is most common in nature and essential for the environmental spreading of microorganisms and their pathogenicity, since quiescent cells develop persistence to antimicrobial agents. Despite their important role313s, quiescent cells remain poorly studied and the mechanisms promoting quiescence maintenance remain elusive. The current thesis aimed at characterizing the physiological roles of eisosomes in quiescent yeasts. In total, results of this thesis showed that eisosomes expanded specifically in quiescent yeasts and promoted their long-term survival. The protective role of eisosomes was associated with the Flavodoxin-Like proteins (FLPs) they host, with ubiquinone oxidoreductase activity protecting quiescent cells from lipid peroxidation and ferroptosis. Eisosomes were found among the most highly expanding cellular components during adaptation to quiescence by proteomics analysis. Confocal microscopy and western blotting further showed that the core proteins of eisosomes, i.e., the BAR domain Pil1 and Lsp1 and the MARVEL Nce102, displayed several-fold induction post-glucose depletion. Both the number of eisosomes and their protein levels increased gradually upon glucose depletion and furthermore during the ethanol utilization phase. The above, suggested an important role of eisosomes in quiescence. Next, the proteins involved in the expansion of eisosomes in quiescence were determined. As in exponentially growing cells, the organization of eisosomes in quiescence required Pil1 and Nce102. Additionally, Lsp1 was identified as necessary for the optimal eisosome expansion and sufficient for the assembly of functional eisosomes even in the absence of Pil1. Given that Lsp1 was neither necessary nor sufficient for eisosome assembly in exponential phase, these results suggested that Lsp1 exerts its main physiological role in quiescence. Consequently, for studying the role of eisosomes in quiescence, a strain carrying deletion of both PIL1 and LSP1 was constructed. The expansion of eisosomes post-glucose depletion showed heterogeneity. To test the correlation with the quiescence-senescence heterogeneity in the population, two different approaches were used. First, quiescent cells were isolated with density gradient centrifugation. Indeed, eisosome expansion occurred in the dense, quiescent enriched fragment. Second, the morphology of the mitochondrial network was used as a single-cell marker of the metabolic state of the cell and of quiescence. Confocal microscopy verified that eisosomes expanded specifically in respiratory-active quiescent cells forming vesicular morphology of their mitochondrial network. Overall, the expansion of eisosomes showed very high correlation with quiescence. Cells with optimal eisosome expansion had more than 89% probability of being quiescent in all time points tested. Antithetically, cells with defective eisosome expansion eventually became senescent or dead. In support of eisosomes expanding specifically in respiratory-active cells, confocal microscopy and western blotting showed that acute carbon starvation was not sufficient to promote optimal expansion of eisosomes. Rather, the presence of a non-fermentable carbon source in the medium, like ethanol, was required. The requirement for respiration was further verified by the defective induction of Pil1 post-glucose depletion in mutants of the respiratory chain. The above strongly indicated that eisosomes are specifically induced in respiratory-active quiescent cells, while optimal eisosome expansion requires the capacity of oxidative phosphorylation. Next, the role of eisosomes in quiescence was examined. The eisosome-null mutant showed defective post-glucose depletion growth, accompanied by reduced utilization of ethanol due to defective mitochondrial functionality. Eisosome-null cells displayed reduced long-term survival and quiescence maintenance, as observed at the single cell level using the morphology of the mitochondrial network. The eisosome-null population, even though fully capable of initially forming quiescent cells with vesicular mitochondria, acquired earlier higher percentage of senescent and dead cells. These results indicated that eisosomes are possibly required for quiescence maintenance. The protective role of eisosomes in quiescence was found to be associated with the stabilization of the three eisosome-resident FLPs with potential antioxidant roles. The FLPs showed many-fold induction in quiescence. Most importantly, in the absence of eisosomes, FLPs displayed 3-8 times reduced protein levels and/or defective plasma membrane targeting in quiescent cells. Consistently, the FLP-null strain phenocopied the eisosome-null strain. Conclusively, stabilization of the FLPs at the plasma membrane was found to be an important function of eisosomes for promoting long-term quiescence maintenance. The mechanism by which FLPs affect quiescent maintenance was investigated. One of the FLPs, shows ubiquinol-regenerating activity. Ubiquinol is a lipophilic antioxidant protecting cells from lipid peroxidation and ferroptosis. Ferroptosis is a recently described form of non-apoptotic cell death driven by peroxidation of polyunsaturated fatty acid (PUFA) -containing phospholipids due to the oxidative properties of iron. An analogue human enzyme, namely Fsp1 with ubiquinol-generating activity at the plasma membrane, protects human cells from ferroptosis. Consistent with the hypothesis that FLPs act analogously to Fsp1, eisosome-null cells and especially FLP-null cells were sensitive to supplementation with PUFAs, which are more prone to peroxidation. Targered lipidomics revealed that eisosome-null and FLP-null quiescent cells accumulated several-fold increased levels of (per)oxidized phosphatidylethanolamine. In agreement with the previous, the defective respiratory growth and the reduced long-term survival of eisosome-null and FLP-null cells was rescued by addition of the lipophilic antioxidant α-tocopherol. Like in mammalian cells, FLPs in yeast were found to counteract lipid peroxidation in parallel with the glutathione peroxidases Gpx1/2/3. A strain lacking both protective mechanisms showed synthetic hypersensitivity to PUFAs and PUFA-dependent cell death. This cell death could be rescued by co-treatment with either α-tocopherol or an iron chelator. The above results suggested that this PUFA-dependent cell death shows typical characteristics of ferroptosis. Finally, genetic evidence was obtained that FLPs are required for regeneration of extramitochondrial ubiquinol, by taking advantage of the cqd1Δ mutant which results in excess ubiquinone export to extra-mitochondrial membranes. Lack of Cqd1 rescued the hypersensitivity of a GPX-null strain to PUFAs. However, lack of FLPs was epistatic to deletion of CQD1, suggesting that FLPs are the main extra-mitochondrial ubiquinone reductases. The results described in this thesis reveal an important physiological role of the compartmentalization of the plasma membrane in quiescence. Eisosomes, by stabilizing the FLPs at the plasma membrane, protect quiescent cells from lipid peroxidation and ferroptosis. These results propose for the first time the existence of ferroptotic cell death in yeast and identify two independent ferroptosis-protective mechanisms as essential for fungal quiescence maintenance. The quiescent-specific roles of eisosomes and FLPs make them promising targets to counteract the stress-resistance and drug persistence of quiescent fungal cells. Finally, this thesis establishes PUFA-supplemented yeast as a model system for future ferroptosis studies and provides a complete report of the proteome of quiescent wild type and mutant yeasts, which are expected to lead to the discovery of unexplored aspects of quiescence in future studies. Η πλασματική μεμβράνη των κυττάρων αποτελεί πλατφόρμα εκτέλεσης πληθώρας βιολογικών διεργασιών. Για τον συντονισμό των πολύπλοκων αυτών διεργασιών η πλασματική μεμβράνη εμφανίζει πλευρική οργάνωση σε εξειδικευμένα διαμερίσματα/επικράτειες. Στην πλασματική μεμβράνη του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae έχουν μέχρι σήμερα αναγνωριστεί 8 διακριτά μεμβρανικά διαμερίσματα. Ένα από τα πιο εκτενέστερα μελετημένα διαμερίσματα είναι το μεμβρανικό διαμέρισμα που φιλοξενεί τον μεταφορέα αργινίνης Can1. Το μεμβρανικό διαμέρισμα της Can1 (MCC) συνεντοπίζεται με ένα υποφλοιώδες πρωτεϊνικό σύμπλοκο που είναι γνωστό με τον όρο εισόσωμα. Προηγούμενα ερευνητικά δεδομένα αναφέρoυν ότι τα εισοσώματα στο ζυμομύκητα εκτελούν ρόλους ‘αποθηκών’ μεταφορέων σε συνθήκες σύντομης και αναστρέψιμης έλλειψης θρεπτικών. Ωστόσο, ο ρόλος των εισοσωμάτων σε συνθήκες μακροπρόθεσμης έλλειψης θρεπτικών δεν έχει μελετηθεί. Η μελέτη των εισοσωμάτων σε μακροπρόθεσμη έλλειψη θρεπτικών είναι ιδιαιτέρως σημαντική, λόγω του σχηματισμού αδρανών κυττάρων στη συνθήκη αυτή. Πιο συγκεκριμένα, σε μία κλειστή καλλιέργεια του ζυμομύκητα τα κύτταρα αρχικά μεταβολίζουν τη γλυκόζη μέσω αλκοολικής ζύμωσης και αυξάνονται εκθετικά. Μετά την εξάντληση της γλυκόζης (φάση διαύξησης), οι ζύμες προσαρμόζουν τον μεταβολισμό τους σε οξειδωτική φωσφορυλίωση, ώστε να μεταβολίσουν αερόβια την αιθανόλη που παρήγαγαν κατά την εκθετική φάση. Σε αυτή τη φάση ανάπτυξης, τα κύτταρα της ζύμης διαφοροποιούνται σε διακριτούς πληθυσμούς: τα αδρανή, τα γηρασμένα και τα νεκρά κύτταρα. Εξ ορισμού, τα αδρανή κύτταρα εμφανίζουν αναστρέψιμη παύση του κυτταρικού τους πολλαπλασιασμού και μπορούν να ανακτήσουν αύξηση όταν τα θρεπτικά γίνουν και πάλι διαθέσιμα. Επιπλέον, τα αδρανή κύτταρα της ζύμης και άλλων μυκήτων εμφανίζουν αυξημένη ανθεκτικότητα σε διάφορα στρες και μακροπρόθεσμη βιωσιμότητα. Τα αδρανή κύτταρα της ζύμης, συγκεκριμένα, είναι επίσης ικανά να πραγματοποιήσουν αερόβιο καταβολισμό της αιθανόλης/ κυτταρική αναπνοή στα μιτοχόνδριά τους. Αντίθετα, τα γηρασμένα και τα νεκρά κύτταρα είναι ανίκανα να ανακτήσουν αύξηση, εμφανίζουν χαρακτηριστικά απόπτωσης και αδυναμία καταβολισμού της αιθανόλης. Η κυτταρική αδράνεια είναι ιδιαίτερα σημαντική για όλους του οργανισμούς. Αποτελεί το πιο κοινό στάδιο του κύκλου ζωής των μικροοργανισμών στη φύση και είναι απαραίτητη για διασπορά των μικροοργανισμών στο περιβάλλον. Παράλληλα, όπως έχει δειχθεί από προηγούμενες μελέτες, η ικανότητα αδράνειας εμπλέκεται στην παθογένεια των μικροοργανισμών. Πιο συγκεκριμένα, τα αδρανή κύτταρα εμφανίζουν επίμονη ανθεκτικότητα (μία μορφή μη γενετικά καθοριζόμενης ανθεκτικότητας) σε διάφορα αντιμυκητιακά φάρμακα, τα οποία στοχεύουν κατά κανόνα αυξανόμενα κύτταρα και όχι αδρανή. Παρά την αδιαμφισβήτητη σημασία των αδρανών κυττάρων, η μελέτη τους παραμένει σχετικά περιορισμένη και οι μηχανισμοί που προωθούν τη διατήρηση της κυτταρικής αδράνειας μόνο τα τελευταία χρόνια έχουν αρχίσει να μελετώνται συστηματικά. Η συγκεκριμένη διατριβή είχε σαν στόχο τη μελέτη και τον χαρακτηρισμό του φυσιολογικού ρόλου των εισοσωμάτων στα αδρανή κύτταρα της ζύμης. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα της διατριβής έδειξαν ότι ο αριθμός των εισοσωμάτων αυξάνει συγκεκριμένα στα αδρανή κύτταρα της ζύμης μετά την εξάντληση γλυκόζης και ότι τα εισοσώματα χρειάζονται για τη μακροημέρευσή τους. Ο προστατευτικός ρόλος των εισοσωμάτων σχετίζεται με τις ελλειπώς μελετημένες πρωτεΐνες της οικογένειας των φλαβοδοξινών που φιλοξενούνται στην πλασματική μεμβράνη, οι οποίες είναι ευρέως γνωστές σαν Flavodoxin-Like Proteins ή εν συντομία FLPs. Οι πρωτεΐνες FLPs εμφανίζουν ενεργότητα οξειδοαναγωγασών του λιπιδίου ουβικουινόνη, ανακυκλώνοντας έτσι την ανηγμένη μορφή του λιπιδίου (ουβικουινόλη) στην πλασματική μεμβράνη. Η ουβικουινόλη, συγκεκριμένα, δρώντας σαν λιπόφιλο αντιοξειδωτικό, προστατεύει τα αδρανή κύτταρα από υπεροξείδωση λιπιδίων και από μία μορφή κυτταρικού θανάτου γνωστή με τον όρο φερρόπτωση (ferroptosis). Η φερρόπτωση είναι μια πρόσφατα χαρακτηρισμένη μορφή μη-αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από συσσώρευση υπεροξειδωμένων λιπιδίων λόγω των οξειδωτικών ιδιοτήτων του σιδήρου. Πιο αναλυτικά, αποτελέσματα πρωτεομικής ανάλυσης έδειξαν ότι τα εισοσώματα εμφανίζονται μεταξύ των κυτταρικών διαμερισμάτων με τη μεγαλύτερη επέκταση κατά την μετάβαση των κυττάρων σε αδράνεια. Δεδομένα συνεστιακής μικροσκοπίας και ανάλυσης western έδειξαν ότι οι κύριες πρωτεΐνες των εισοσωμάτων [οι πρωτεΐνες με επικράτεια BAR (for Bin1, Amphiphysin and Rvs proteins) Pil1 και Lsp1 και η πρωτεΐνη της οικογένειας MARVEL (MAL and Related proteins for VEsicle trafficking and membrane Link) Nce102] εμφανίζουν πολλαπλάσια επαγωγή μετά την εξάντληση γλυκόζης. Τόσο ο αριθμός των εισοσωμάτων όσο και τα πρωτεϊνικά επίπεδα των Pil1, Lsp1 και Nce102 αυξάνουν σταδιακά όσο η γλυκόζη καταναλώνεται και εμφανίζουν περαιτέρω επαγωγή κατά την φάση μεταβολισμού της αιθανόλης. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι τα εισοσώματα έχουν πιθανά σημαντικό ρόλο κατά την μετάβαση των κυττάρων στην κατάσταση αδράνειας. Στη συνέχεια μελετήθηκαν οι πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην επαγωγή και οργάνωση των εισοσωμάτων μετά την εξάντληση γλυκόζης. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες κυττάρων κατά την εκθετική φάση, η οργάνωση των εισοσωμάτων στα αδρανή κύτταρα χρειάζεται τις πρωτεΐνες Pil1 και Nce102. Επιπροσθέτως, δεδομένα της παρούσας διατριβής προτείνουν ένα ρόλο της Lsp1 στη φάση αυτή. Πιο συγκεκριμένα, η Lsp1 βρέθηκε να είναι αναγκαία για τη βέλτιστη επαγωγή των εισοσωμάτων, αλλά και ικανή για τη συγκρότηση λειτουργικών εισοσωμάτων ακόμα και σε κύτταρα που φέρουν απαλοιφή του γονιδίου της Pil1. Δεδομένου ότι η Lsp1 δεν εμπλέκεται στην οργάνωση των εισοσωμάτων στην εκθετική φάση, τα παραπάνω αποτελέσματα προτείνουν ότι ο φυσιολογικός ρόλος της Lsp1 σχετίζεται συγκεκριμένα με την κυτταρική αδράνεια. Συνεπώς, προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος των εισοσωμάτων στα αδρανή κύτταρα του ζυμομύκητα κατασκευάστηκε μεταλλαγμένο στέλεχος με απαλοιφές τόσο του γονιδίου PIL1 όσο και του LSP1. Η επαγωγή των εισοσωμάτων εμφάνισε ετερογένεια στα κύτταρα της ζύμης μετά την εξάντληση γλυκόζης. Σχετίζεται η ετερογένεια αυτή με τους διακριτούς πληθυσμούς κυττάρων που δημιουργούνται μετά τη εξάντληση γλυκόζης; Το ερώτημα αυτό προσεγγίστηκε με δύο διαφορετικούς τρόπους. Πρώτον, τα αδρανή κύτταρα, τα οποιά απομονώθηκαν με φυγοκέντρηση σε κλίση συγκέντρωσης στον πυκνό κλάσμα, ελέγχθηκαν ως προς την επαγωγή των εισοσωμάτων. Πράγματι, τα κύτταρα στο πυκνό κλάσμα εμφάνισαν βέλτιστη επαγωγή εισοσωμάτων. Δεύτερον, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η μορφολογία των μιτοχονδρίων αποτελεί αξιόπιστο μικροσκοπικό δείκτη της κυτταρικής αδράνειας και της μεταβολικής κατάστασης των κυττάρων. Δεδομένα συνεστιακής μικροσκοπίας έδειξαν ότι τα εισοσώματα επάγονται συγκεκριμένα στα αδρανή κύτταρα που χαρακτηρίζονται από κυστιδιακή μορφολογία του δικτύου των μιτοχονδρίων τους. Τα κύτταρα αυτά, έχει επιπλέον δειχθεί ότι διαθέτουν ικανότητα κυτταρικής αναπνοής μετά την εξάντληση της γλυκόζης. Αντίθετα, τα κύτταρα με σφαιρικά συσσωματώματα των μιτοχονδρίων τους, που είναι γηρασμένα και μη-ικανά οξειδωτικής φωσφορυλίωσης, εμφάνισαν ελλιπή επαγωγή εισοσωμάτων. Συνολικά η επαγωγή των εισοσωμάτων έδειξε υψηλή συσχέτιση με την κυτταρική αδράνεια. Κύτταρα με βέλτιστη επαγωγή εμφάνισαν πάνω 89% πιθανότητα να είναι αδρανή, σε όλες τις φάσεις που μελετήθηκαν. Αντιθέτως, κύτταρα με μειωμένη επαγωγή συνήθως ήταν γηρασμένα ή νεκρά. Σε συμφωνία με την επαγωγή των εισοσωμάτων συγκεκριμένα στα αδρανή κύτταρα κατά τη φάση μεταβολισμού της αιθανόλης, η βέλτιστη επαγωγή των εισοσωμάτων φαίνεται να προϋποθέτει ενεργή κυτταρική αναπνοή. Αποτελέσματα από συνεστιακή μικροσκοπία και ανάλυση western έδειξαν ότι τεχνητή εξάντληση των πηγών άνθρακα από το θρεπτικό των κυττάρων δεν αρκεί για να προκαλέσει τη βέλτιστη επαγωγή των εισοσωμάτων. Απεναντίας, η παρουσία πηγής άνθρακα στο θρεπτικό που μεταβολίζεται αερόβια στα μιτοχόνδρια π.χ. αιθανόλη, ήταν απαραίτητη προϋπόθεση για την επαγωγή. Παρομοίως, στελέχη που φέρουν απαλοιφές σε γονίδια της αναπνευστικής αλυσίδας των μιτοχονδρίων εμφάνισαν ελλιπή επαγωγή της Pil1 μετά την εξάντληση γλυκόζης. Τα παραπάνω αποτελέσματα συνηγορούν στο ότι η επαγωγή των εισοσωμάτων μετά την εξάντληση γλυκόζης συμβαίνει συγκεκριμένα στα αδρανή κύτταρα και προϋποθέτει την ενεργή λειτουργία της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης. Στη συνέχεια, μελετήθηκε ο ρόλος των εισοσωμάτων στην κυτταρική αδράνεια. Το στέλεχος χωρίς εισοσώματα εμφάνισε προβληματική ανάπτυξη μετά την εξάντληση γλυκόζης και μειωμένο καταβολισμό της αιθανόλης λόγω προβληματικής λειτουργίας των μιτοχονδρίων. Κύτταρα χωρίς εισοσώματα εμφάνισαν μειωμένη μακροπρόθεσμη βιωσιμότητα αλλά και ελλιπή διατήρηση της κυτταρικής αδράνειας. Πιο συγκεκριμένα, ο μεταλλαγμένος πληθυσμός, ενώ εμφάνισε κανονικά αδρανή κύτταρα με κυστιδιακά μιτοχόνδρια μετά την εξάντληση γλυκόζης, συσσώρευσε νωρίτερα στην καλλιέργεια αυξημένο ποσοστό γηρασμένων και νεκρών κυττάρων με βάση την μορφολογία του δικτύου των μιτοχονδρίων τους. Συμπερασματικά, τα εισοσώματα φαίνεται να χρειάζονται για τη διατήρηση της κυτταρικής αδράνειας. Τα εισοσώματα βρέθηκαν να προωθούν την κυτταρική αδράνεια μέσω των φλαβοδοξινών/FLPs που φιλοξενούν. Όπως και οι κύριες πρωτεΐνες των εισοσωμάτων έτσι και οι FLPs εμφάνισαν πολλαπλάσια επαγωγή στα αδρανή κύτταρα φυσικού τύπου. Ωστόσο, απουσία των εισοσωμάτων τα πρωτεϊνικά επίπεδα των FLPs μειώθηκαν 3-8 φορές. Επιπλέον, η τοπολογία τους φάνηκε αλλοιωμένη σε σχέση με τα κύτταρα φυσικού τύπου. Πιο συγκεκριμένα, απουσία των εισοσωμάτων η κατανομή των FLPs στην πλασματική μεμβράνη μετατράπηκε από στικτή σε ομοιογενή, ενώ η στρατολόγηση των FLPs στην πλασματική μεμβράνη ήταν μειωμένη. Σε συμφωνία με την υπόθεση ότι οι φαινότυποι του στελέχους χωρίς εισοσώματα οφείλονται στα μειωμένα επίπεδα FLPs στην πλασματική μεμβράνη, το στέλεχος που φέρει απαλοιφές των γονιδίων FLPs προσομοίασε φαινοτυπικά το στέλεχος χωρίς εισοσώματα. Συνολικά, τα δεδομένα υποστηρίζουν πως ένας σημαντικός ρόλος των εισοσωμάτων κατά την κυτταρική αδράνεια είναι η σταθεροποίηση των FLPs στην πλασματική μεμβράνη Παράλληλα, διερευνήθηκε ο μηχανισμός μέσω του οποίου oι FLPs εμπλέκονται στην διατήρησης της αδράνειας. Παλαιότερα δεδομένα έχουν δείξει ότι οι FLPs έχουν πιθανούς αντιοξειδωτικούς ρόλους και μία τουλάχιστον από τις FLPs εμφανίζει ενζυμική ενεργότητα αναγέννησης της ουβικουινόλης. Η ουβικουινόλη είναι ένα ισχυρό λιπόφιλο αντιοξειδωτικό που προστατεύει τα κύτταρα από υπεροξείδωση λιπιδίων και φερρόπτωση. Ο όρος φερρόπτωση ή ferroptosis αναφέρεται σε μία πρόσφατα χαρακτηρισμένη μορφή μη-αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από υπεροξείδωση φωσφολιπιδίων με πολυ-ακόρεστα λιπαρά οξέα λόγω των οξειδωτικών ιδιοτήτων του σιδήρου (ferrous iron). Ένα ένζυμο με βιοχημική ενεργότητα ανάλογη των FLPs στα κύτταρα των θηλαστικών, με το όνομα Ferroptosis Suppressor Protein 1 (Fsp1), έχει βρεθεί να εμπλέκεται στην προστασία από φερρόπτωση. Σε συμφωνία με την υπόθεση ότι τα FLPs έχουν ανάλογους ρόλους με το Fsp1, κύτταρα χωρίς εισοσώματα ή FLPs εμφάνισαν ευαισθησία σε πολυ-ακόρεστα λιπαρά οξέα, τα οποία είναι πιο επιρρεπή στην οξείδωση σε σχέση με τα μονοακόρεστα. Επιπλέον δεδομένα από στοχευμένη επιλιπιδομική ανάλυση έδειξαν ότι κύτταρα χωρίς εισοσώματα ή FLPs συσσωρεύουν πολλαπλάσια αυξημένα επίπεδα υπεροξειδωμένων μορφών του λιπιδίου φωσφατιδυλαιθανολαμίνη. Προς υποστήριξη του ερευνητικού μοντέλου, η ελλιπής ανάπτυξη στη φάση μεταβολισμού της αιθανόλης και η μειωμένη βιωσιμότητα των μεταλλαγμένων στελεχών μπορούσε να αναστραφεί με προσθήκη του λιπόφιλου αντιοξειδωτικού α-τοκοφερόλη. Όπως και στα ανθρώπινα κύτταρα, έτσι και στη ζύμη, οι FLPs φάνηκε να προστατεύουν από υπεροξείδωση λιπιδίων παράλληλα με τον μηχανισμό της γλουταθειόνης- υπεροξειδασών γλουταθειόνης Gpx1/2/3. Στέλεχος που φέρει συνδυαστικές απαλοιφές των γονιδίων των FLPs και Gpx1/2/3 εμφάνισε αυξημένη ευαισθησία σε πολυ-ακόρεστα λιπαρά οξέα και ραγδαία αύξηση στα ποσοστά νεκρών κυττάρων παρουσία πολυ-ακόρεστων λιπαρών οξέων. Τα ποσοστά αυτά μπορούσαν να αναστραφούν είτε με την προσθήκη του λιπόφιλου αντιοξειδωτικού α-τοκοφερόλη, είτε με την προσθήκη ενός χειλικού παράγοντα που δεσμεύει σίδηρο. Κατά συνέπεια, ο κυτταρικός θάνατος που εμφάνισε το στέλεχος φαίνεται να εξαρτάται από υπεροξείδωση λιπιδίων και από τον σίδηρο και άρα προσομοιάζει την φερρόπτωση. Τέλος, γενετικά δεδομένα υποστήριξαν ότι οι FLPs είναι πράγματι απαραίτητες για την αναγέννηση της ουβικουινόλης σε μεμβράνες εκτός των μιτοχονδριακών. Πιο συγκεκριμένα, το μεταλλαγμένο στέλεχος cqd1Δ έχει προηγουμένως δειχθεί να περιέχει περίσσεια εξω-μιτοχονδριακής ουβικουινόνης. Απαλοιφή του CQD1 μπορούσε να καταστείλει την ευαισθησία του στελέχους με απαλοιφές των GPX1/2/3 σε πολυ-ακόρεστα λιπαρά οξέα. Ωστόσο, η καταστολή αυτή δεν παρατηρήθηκε όταν το στέλεχος έφερε επιπλέον απαλοιφές των FLPs, καθώς απαλοιφή των FLPs ήταν επιστατική στην απαλοιφή του CQD1. Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν ότι οι FLPs είναι οι κύριες οξειδοαναγωγές της ουβικουινόνης εκτός των μιτοχονδρίων. Τα αποτελέσματα που περιέχονται στην παρούσα διατριβή αποκαλύπτουν ένα σημαντικό φυσιολογικό ρόλο της διαμερισματοποίησης της πλασματικής μεμβράνης στην κυτταρική αδράνεια. Τα εισοσώματα, σταθεροποιώντας τα FLPs, προστατεύουν τα αδρανή κύτταρα της ζύμης από υπεροξείδωση λιπιδίων και από φερρόπτωση. Τα δεδομένα αυτά προτείνουν για πρώτη φορά την παρουσία φερρόπτωσης στα κύτταρα του ζυμομύκητα και ταυτοποιούν δύο ανεξάρτητους προστατευτικούς μηχανισμούς ως απαραίτητους για την μακροημέρευση των αδρανών κυττάρων. Ο προστατευτικός ρόλος των εισοσωμάτων και των FLPs συγκεκριμένα στα αδρανή κύτταρα, τα καθιστά υποσχόμενους στόχους για την αντιμετώπιση της επίμονης ανθεκτικότητας των αδρανών κυττάρων σε αντιμυκητιακά. Επιπλέον, η παρούσα διατριβή εισαγάγει την χρήση κυττάρων ζύμης, αναπτυσσομένων σε θρεπτικό με προσθήκη πολυ-ακόρεστων λιπαρών οξέων, σαν σύστημα μοντέλο για την μελέτη της φερρόπτωσης. Τέλος, στην διατριβή αυτή περιλαμβάνονται ολοκληρωμένα δεδομένα πρωτεομικής ανάλυσης των αδρανών κυττάρων φυσικού τύπου αλλά και σχετικών μεταλλαγμάτων. Τα δεδομένα αυτά αναμένεται να αποκαλύψουν ανεξερεύνητες εκφάνσεις της κυτταρικής αδράνειας σε μελλοντικές έρευνες.
Γλώσσα:	Αγγλικά
Τόπος δημοσίευσης:	Athens, Greece
Σελίδες:	349
Θεματική κατηγορία:	[EL] Βιολογία[EN] Biology [EL] Βιολογία κυττάρου[EN] Cell Biology [EL] Βιοχημεία και Μοριακή βιολογία[EN] Biochemistry and Molecular Biology [EL] Μικροβιολογία[EN] Microbiology
Κάτοχος πνευματικών δικαιωμάτων:	© The Author(s) 2023
Σχετίζεται με:	The Bul1/2 alpha-arrestins promote ubiquitylation and endocytosis of the Can1 permease upon cycloheximide-induced TORC1-hyperactivation
Σημειώσεις:	The implementation of the doctoral thesis was co-financed by Greece and the European Union (European Social Fund-ESF) through the Operational Programme “Human Resources Development, Education and Lifelong Learning” in the context of the Act “Enhancing Human Resources Research Potential by undertaking a Doctoral Research” Sub-action 2: IKY Scholarship Programme for PhD candidates in the Greek Universities. Η υλοποίηση της διδακτορικής διατριβής συγχρηματοδοτήθηκε από την Ελλάδα και την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Ανάπτυξη Ανθρώπινου Δυναμικού, Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση», 2014-2020, στο πλαίσιο της Πράξης «Ενίσχυση του ανθρώπινου δυναμικού μέσω της υλοποίησης διδακτορικής έρευνας Υποδράση 2: Πρόγραμμα χορήγησης υποτροφιών ΙΚΥ σε υποψηφίους διδάκτορες των ΑΕΙ της Ελλάδας», στη γλώσσα σύνταξης της Διδακτορικής Διατριβής.
Εμφανίζεται στις συλλογές:	Υποψήφιοι διδάκτορες