1. Αποθετήριο Παραδοτέων Υποτρόφων Δράσεων ΕΣΠΑ Τριτοβάθμιας Εκπαίδευσης 2017-2023
2. Όλο το Αποθετήριο
3. Υποψήφιοι διδάκτορες

Τύπος:	Διδακτορική διατριβή
Τίτλος:	Μελέτη του παθοφυσιολογικού ρόλου του Dnajc11 γονιδίου σε ένα μοντέλο νευρομυικής νόσου στο ποντίκι
Εναλλακτικός τίτλος:	Studying the pathophysiological role of Dnajc11 role in a mouse model of neuromuscular disease
Συγγραφέας:	[EL] Βιολιτζή, Φωτεινή[EN] Violitzi, Foteini
Επιβλέπων διατριβής:	[EL] Ντούνη, Ελένη[EN] Douni, Eleni
Συμβουλευτική επιτροπή:	[EL] Ηλιόπουλος, Ηλίας[EN] Eliopoulos, Elias [EL] Παναγιώτου, Γεώργιος[EN] Panayotou, George
Μέλος εξεταστικής επιτροπής:	[EL] Λάμπρου, Νικόλαος [EL] Κοσμίδης, Νικόλαος[EN] Cosmidis, Nikos [EL] Κουμάντου, Βασιλική[EN] Koumandou, Vassiliki Lila [EL] Χαραλάμπους, Σύλβα[EN] Haralambous, Sylva
Ημερομηνία:	Οκτ-2019
Περίληψη:	Οι μιτοχονδριακές ασθένειες εμφανίζονται κυρίως με νευρολογικά συμπτώματα, ενώ στη πλειοψηφία τους παραμένουν ανίατες λόγω της άγνωστης αιτιολογίας τους. Η μελέτη της μοριακής βάσης και των παθοφυσιολογικών μηχανισμών είναι δύσκολη στη περίπτωση των μιτοχονδριακών ασθενειών καθώς δεν υπάρχουν τα κατάλληλα γενετικά μοντέλα. Πρόσφατα, το γονίδιο Dnajc11 αναγνωρίστηκε ως ένα νέο γενετικό αίτιο για την εμφάνιση ενός θνησιγόνου νευρομυϊκού φαινοτύπου στα DnaJC11spc/spc ποντίκια που χαρακτηρίζεται από δομικές αλλαγές των μιτοχονδρίων στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Η DNAJC11 πρωτεΐνη εντοπίζεται στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη και φαίνεται να αλληλεπιδρά με μέλη του συμπλόκου MICOS που οργανώνει τις αναδιπλώσεις της εσωτερικής μεμβράνης των μιτοχονδρίων. Ωστόσο, η λειτουργία της πρωτεΐνης DNAJC11 παραμένει άγνωστη και η ανάλυση των DnaJC11spc/spc ποντικιών αναμένεται να διελευκάνει τους παθογενετικούς μηχανισμούς που επάγονται από την απουσία της. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε: α) Ανάλυση της ενεργότητας των μιτοχονδρίων σε πληθώρα ιστών από DnaJC11spc/spc ποντίκια προκειμένου να ανιχνευθεί η επίδραση της έλλειψης της DNAJC11 πρωτεΐνης στη μιτοχονδριακή λειτουργία, β) Ανίχνευση απορυθμισμένων πρωτεϊνικών δικτύων και μονοπατιών στον εγκέφαλο DnaJC11spc/spc ποντικιών με πρωτεομική ανάλυση για την κατανόηση των εμπλεκόμενων παθογενετικών μηχανισμών, γ) Μελέτη των αλληλεπιδράσεων της DNAJC11 (ποντικού και ανθρώπου) για την κατανόηση της λειτουργίας της μέσω σήμανσης με το πεπτίδιο FLAG (DNAJC11-FLAG), έκφρασής της στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά ΗΕΚ293FΤ, ανοσοκατακρήμνισης με αντι-FLAG σφαιρίδια και ταυτοποίηση των συμπλόκων που περιέχουν την DNAJC11-FLAG με πρωτεομική ανάλυση, δ) Δημιουργία και χαρακτηρισμός διαγονιδιακών ποντικιών που εκφράζουν την DNAJC11-FLAG πρωτεΐνη (TgDNAJC11-FLAG), για την ανίχνευση αλληλεπιδράσεων της DNAJC11 in vivo ώστε να διαπιστωθούν ιστοειδικές αλληλεπιδράσεις και ε) Λειτουργικός χαρακτηρισμός των περιοχών J και DUF3395 της DNAJC11 πρωτεΐνης ώστε να διαπιστωθεί η εμπλοκή της καθεμίας τόσο στις αλληλεπιδράσεις με άλλες πρωτεΐνες όσο και στην μιτοχονδριακή τοπολογία της DNAJC11. Η μιτοχονδριακή ανάλυση έδειξε σημαντική μείωση της μιτοχονδριακής ενεργότητας σε ποικίλους ιστούς των DnaJC11spc/spc ποντικιών, όπως σε εγκέφαλο, παρεγκεφαλίδα, καρδιά, νεφρούς, σπλήνα και θύμο, συμβαδίζοντας με την ανώμαλη μορφολογία των μιτοχονδρίων που είχε παρατηρηθεί στο παρελθόν. Συγκριτική πρωτεομική ανάλυση ολικού εκχυλίσματος εγκεφάλου από DnaJC11spc/spc και WT ποντίκια φανέρωσε δραματική μείωση στις μιτοχονδριακές πρωτεΐνες, κυρίως στις πρωτεΐνες της εσωτερικής μεμβράνης, καθώς και πρωτεϊνών που εντοπίζονται στις συνάψεις. Επίσης ανιχνεύτηκε αυξημένη ουβικιτινυλίωση της πρωτεΐνης GS, που συμμετέχει στην ανακύκλωση νευροδιαβιβαστών, στον εγκέφαλο των DnaJC11spc/spc ποντικών, χωρίς ωστόσο να επηρεάζονται τα επίπεδα έκφρασης της. Προκειμένου να κατανοηθεί η λειτουργία της DNAJC11 μελετήθηκε το δίκτυο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεών της με έκφραση της DNAJC11-FLAG πρωτεΐνης τόσο στην κυτταρική σειρά HEK293FT όσο και σε διαγονιδιακά ποντίκια TgDNAJC11-FLAG. Συνολικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής επιβεβαίωσαν τις αλληλεπιδράσεις της DNAJC11 με μέλη του συμπλόκου ΜΙCOS που καθορίζει στην αναδίπλωση της μεμβράνης cristae και για πρώτη φορά εντόπισε αλληλεπιδράσεις με μιτοχονδριακές πρωτεΐνες τόσο της εξωτερικής μεμβράνης (VDACs) όσο και της εσωτερικής (ANTs) που εμπλέκονται στην παραγωγή και τη διάθεση του ΑΤP στο κύτταρο, και στα δύο συστήματα που μελετήθηκαν. Στην κυτταρική σειρά αναδείχθηκαν αλληλεπιδράσεις με κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες όπως HSP70s, ένζυμα και ριβοσωμικές υπομονάδες, ενώ στον εγκέφαλο αναγνωρίστηκαν αλληλεπιδράσεις με πρωτεΐνες που είναι εμπλουτισμένες στην περιοχή των συνάψεων, αναδεικνύοντας διαφοροποιήσεις που πιθανόν σχετίζονται με ιστοειδική δράση της DNAJC11 αλλά και με το μεταβολικό στάδιο κάθε βιολογικού συστήματος. Λειτουργικός χαρακτηρισμός της WT DNAJC11 και δομικών μεταλλαγμάτων της έδειξε πως η περιοχή J ευθύνεται για τη μιτοχονδριακή τοπολογία της DNAJC11, ενώ η περιοχή DUF3395 εμπλέκεται στις πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις της. Τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποδεικνύουν τη συμβολή της DNAJC11 στη φυσιολογική λειτουργία και δομή των μιτοχονδρίων στους περισσότερους ιστούς. Οι μιτοχονδριακές ανωμαλίες των DnaJC11spc/spc ποντικιών και το πλούσιο δίκτυο αλληλεπιδράσεων της DNAJC11, αναδεικνύουν την εμπλοκή της σε βασικούς παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς που συνδέουν το μιτοχόνδριο με την παθογένεση νευροεκφυλιστικών ασθενειών.Τα DnaJC11spc/spc ποντίκια καθώς και τα TgDNAJC11-FLAG ποντίκια αποτελούν μοναδικά γενετικά εργαλεία για την κατανόηση νευρομυϊκών παθήσεων όπου εμπλέκονται τα μιτοχόνδρια. Mitochondrial disorders manifest mainly with neurological symptoms, while the majority remains untreatable due to their unknown etiology. Studying the molecular basis and the pathophysiological mechanisms of mitochondrial diseases is difficult, since there are not enough genetic models. Recently, the Dnajc11 gene was identified as the causative mutation in a deadly neuromuscular phenotype in DnaJC11spc/spc mice characterized by structural mitochondrial abnormalities in central nervous system. DNAJC11 localizes in the outer mitochondrial membrane, where it interacts with members of the MICOS complex, which regulates cristae organization. However, DNAJC11 function remains unknown and analysis of the DnaJC11spc/spc mice is expected to enlighten the pathogenic mechanisms deriving by its absence. In the present thesis: a) we assessed mitochondrial activity in tissues from DnaJC11spc/spc mice in order to detect the effect of DNAJC11 depletion in mitochondrial function, b) deregulated protein networks and pathways in the cerebrum of DnaJC11spc/spc mice were identified through proteomic analysis in order to understand the pathogenic mechanisms involved, c) murine and human DNAJC11 interactions were studied in order to discover its biological role through tag with the FLAG peptide (DNAJC11-FLAG), expression in the human cell line ΗΕΚ293FΤ, immunoprecipitation using anti-FLAG beads and identification of the protein complexes containing DNAJC11-FLAG by LC-MS/MS, d) transgenic mice expressing the DNAJC11-FLAG protein (TgDNAJC11-FLAG) were generated and characterized in order to detect DNAJC11 interactions in vivo and determine its tissue-specific interactions and e) J and DUF domain were functionally characterized for their involvement in protein interactions and subcellular localization of DNAJC11. Mitochondrial analysis revealed severe reduction of the mitochondrial activity in tissues from DnaJC11spc/spc mice such as cerebrum, cerebellum, heart, kidneys, spleen and thymus, falling in line with the morphological abnormalities in mitochondria detected in the past. Comparative proteomic analysis in total protein extracts from the cerebrum of DnaJC11spc/spc and WT mice, revealed reduced expression of proteins located in mitochondria, especially in the inner membrane, and synaptic proteins. Moreover, proteomic analysis showed increased ubiquitination of GS protein, involved in neurotransmitter recycling in the cerebrum of DnaJC11spc/spc mice, without altering its expression. In order to elucidate DNAJC11 biological role we studied its interactome through expression of DNAJC11-FLAG protein in the human cell line HEK293FT and in transgenic mice TgDNAJC11-FLAG. Collectively, the results in this thesis verified DNAJC11 interaction with members of the MICOS complex, that organize mitochondrial cristae formation and for the first time detected interactions with mitochondrial proteins in the outer (VDACs) and inner (ANTs) membrane, participating in ATP biosynthesis and supply in the cell, in both biological systems studied. In HEK293FT cells, DNAJC11 interacts with cytosolic proteins, including HSP70s, enzymes and ribosomal subunits, while in the cerebrum DNAJC11 interactome is enriched in synaptic proteins, indicating differences possibly related with tissue-specific functions of DNAJC11 and the metabolic phase of each biological system. Functional characterization of WT DNAJC11 protein and its structural mutants, revealed the importance of the J domain for the protein’s mitochondrial localization, while the DUF domain is required for its protein interactions The findings of this thesis reveal the participation of DNAJC11 protein in mitochondrial structure and function in most tissues. The mitochondrial abnormalities in DnaJC11spc/spc mice and the plenteous interactome of DNAJC11, suggest that it participates in basic pathophysiological mechanisms connecting mitochondria with neuromuscular disease pathogenesis. Toward this scope, the DnaJC11spc/spc and TgDNAJC11-FLAG mice provide unique genetic tools for understudying mitochondrial-derived neuromuscular disorder.
Γλώσσα:	Ελληνικά
Τόπος δημοσίευσης:	Αθήνα
Σελίδες:	228
Θεματική κατηγορία:	[EL] Επιστήμες Υγείας[EN] Health Sciences
Λέξεις-κλειδιά:	DNAJC11; μιτοχόνδρια; νευρομυϊκές ασθένειες
Κάτοχος πνευματικών δικαιωμάτων:	Βιολιτζή Φωτεινή
Διατίθεται ανοιχτά στην τοποθεσία:	https://www.didaktorika.gr/eadd/handle/10442/46558
Σημειώσεις:	Το έργο συγχρηματοδοτήθηκε από την Ελλάδα και την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Ανάπτυξη Ανθρώπινου Δυναμικού, Εκπαίδευση και Διά Βίου Μάθηση», στο πλαίσιο της Πράξης «Πρόγραμμα Χορήγησης Υποτροφιών για Μεταπτυχιακές Σπουδές Δευτέρου Κύκλου Σπουδών» (MIS5003404), που υλοποιεί το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών (ΙΚΥ).
Εμφανίζεται στις συλλογές:	Υποψήφιοι διδάκτορες