1. Αποθετήριο Παραδοτέων Υποτρόφων Δράσεων ΕΣΠΑ Τριτοβάθμιας Εκπαίδευσης 2017-2023
2. Όλο το Αποθετήριο
3. Υποψήφιοι διδάκτορες

Τύπος:	Διδακτορική διατριβή
Τίτλος:	Διερεύνηση της προγνωστικής και προβλεπτικής σημασίας επιγενετικών βιοδεικτών στον καρκίνο του μαστού και άλλους γυναικολογικούς καρκίνους
Εναλλακτικός τίτλος:	Investigation of prognostic and predictive significance of epigenetic biomarkers in breast cancer and other gynecological cancers
Συγγραφέας:	[EL] Παναγοπούλου-Πανταζή, Μαρία[EN] Panagopoulou-Pantazi, Maria
Επιβλέπων διατριβής:	[EL] Αλεξίου-Χατζάκη, Αικατερίνη[EN] Alexiou-Chatzaki, Ekaterini
Συμβουλευτική επιτροπή:	[EL] Κακολύρης, Στυλιανός[EN] Kakolyris, Stylianos [EL] Κολιός, Γεώργιος[EN] Kolios, George
Μέλος εξεταστικής επιτροπής:	[EL] Μανωλόπουλος, Ευάγγελος[EN] Manolopoulos, Evangelos [EL] Λαμπροπούλου, Μαρία[EN] Lambropoulou, Maria [EL] Ξενίδης, Νικόλαος[EN] Xenidis, Nikolaos [EL] Νένα, Ευαγγελία[EN] Nena, Evangelia
Ημερομηνία:	19/11/2020
Περίληψη:	Η DNA μεθυλίωση αποτελεί τον καλύτερα μελετημένο επιγενετικό μηχανισμό. Κατά τη διαδικασία αυτή πραγματοποιείται προσθήκη μιας μεθυλομάδας στους δακτυλίους των κυτοσινών των CpG δινουκλεοτιδίων των υποκινητών που έχει ως αποτέλεσμα τη γονιδιακή αποσιώπηση. Στον καρκίνο παρατηρείται παρεκκλίνουσα μεθυλίωση συνήθως στους υποκινητές ογκοκατασταλτικών γονιδίων και καταστολέων της μετάστασης με αποτέλεσμα την απώλεια του προστατευτικού τους ρόλου. Έχει αποδειχθεί ότι τα μη φυσιολογικά πρότυπα DNA μεθυλίωσης που υπάρχουν στις κακοήθειες μπορούν να ανιχνευτούν στα βιοϋλικά υγρής βιοψίας των ασθενών και ως εκ τούτου θα μπορούσαν να αξιολογηθούν περαιτέρω ως βιοδείκτες με κλινική αξία. Το ccfDNA μπορεί εύκολα να απομονωθεί από βιολογικά υγρά όπως το πλάσμα/ορό. Στον καρκίνο η ποσότητα του είναι αυξημένη και έχει αποδειχθεί ότι αποτυπώνει τη μοριακή του ταυτότητα. Πλήθος ερευνών πραγματοποιούνται με σκοπό την ταυτοποίηση και αξιολόγηση υπογραφών της DNA μεθυλίωσης στο ccfDNA. Παρόλα αυτά ελάχιστες εξετάσεις βασισμένες στην ανάλυση της DNA μεθυλίωσης στο πλάσμα και άλλα βιολογικά υγρά είναι εγκεκριμένες από τον Αμερικάνικο οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων και διαθέσιμες στην κλινική πράξη. Επιπλέον, υπάρχουν αντικρουόμενα αποτελέσματα σχετικά με τη δομή και την ακεραιότητα του ccfDNA και για το πως θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν τα συγκεκριμένα χαρακτηριστικά ως αξιόπιστοι κλινικοί παράμετροι. Θέλοντας να ανιχνεύσουμε και να αξιολογήσουμε ελάχιστα επεμβατικούς βιοδείκτες μελετήσαμε το προφίλ της DNA μεθυλίωσης συγκεκριμένων γονιδίων σε δύο από τις σημαντικότερες νοσολογικές οντότητες για το γυναικείο πληθυσμό, τον καρκίνο του τραχήλου και του μαστού. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε τρία διακριτά μέρη. Στον τράχηλο της μήτρας έχει αποδειχθεί ότι η μόλυνση από τα στελέχη HRHPV μπορεί να προκαλέσει την παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA. Στην παρούσα μελέτη αξιολογήσαμε τη DNA μεθυλίωση δύο γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο, του BRMS1 και του WNT5A σε τραχηλικά επιχρίσματα 64 γυναικών χωρίς μόλυνση από τα στελέχη HRHPV, σε 70 γυναίκες με αποδεδειγμένη μόλυνση από τα στελέχη HRHPV και σε βιοψίες τραχηλικού ιστού χρησιμοποιώντας qMSP. Επιπλέον στόχος ήταν η ανάλυση της πρωτεϊνικής έκφρασης του BRMS1 με ανοσοϊστοχημεία σε βιοψίες τραχηλικού ιστού και η συσχέτιση της με την κατάσταση μεθυλίωσης του γονιδίου. Η μεθυλίωση του BRMS1 μελετήθηκε για πρώτη φορά στον τράχηλο και ανιχνεύθηκε στο 37,5% των γυναικών χωρίς λοίμωξη από τους HRHPV, ενώ εντοπίστηκε λιγότερο συχνά στις γυναίκες με μόλυνση από τους HRHPV (11,4%) και στις γυναίκες με παθολογική ιστολογία (11,9%). Αντιθέτως, η μεθυλίωση του υποκινητή WNT5A ανιχνεύθηκε συχνότερα στις γυναίκες με μόλυνση από τους HRHPV (22,8%) σε σχέση με τις γυναίκες χωρίς μόλυνση (4,7%). Το ίδιο παρατηρήθηκε και σε σχέση με την ιστολογία, καθώς οι γυναίκες με παθολογική ιστολογία εμφάνιζαν συχνότερα μεθυλιωμένο τον υποκινητή του γονιδίου WNT5A (23,8% έναντι 4,2%). Η ανοσοϊστοχημεία για την έκφραση της πρωτεΐνης BRMS1 πραγματοποιήθηκε για πρώτη φορά στον τράχηλο και αποκάλυψε πυρηνική θετική χρώση στο φυσιολογικό χωρίς HRHPV μόλυνση επιθήλιο, στις τραχηλικές ενδοεπιθηλιακές αλλοιώσεις και στον καρκινικό ιστό, όπου παρατηρήθηκε και περιστασιακή κυτταροπλασματική χρώση. Στον καρκίνο, η έκφραση ήταν ισχυρότερη στις περισσότερο διαφοροποιημένες καρκινικές βλάστες, ενώ απουσίαζε στις καρκινικές βλάστες χαμηλής διαφοροποίησης, πιθανόν λόγω του μηχανισμού της DNA μεθυλίωσης. Τα αποτελέσματά μας αναδεικνύουν την αξία της προσθήκης επιγενετικών βιοδεικτών ως συμπληρωματικά εργαλεία προσυμπτωματικού ελέγχου στη κλινική διαχείριση του καρκίνου του τραχήλου. Στο δεύτερο μέρος, η μελέτη σε δύο ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές τραχήλου και μαστού (HeLa και MCF-7 αντίστοιχα), είχε στόχο την ανάλυση σημαντικών παραμέτρων του ccfDNA in vitro, την περιγραφή της κινητικής και του μηχανισμού απελευθέρωσής του. Επιπλέον, η ανάλυση του προφίλ της DNA μεθυλίωσης, σκοπό είχε να εξετάσει αν τα επιγενετικά φαινόμενα των κυττάρων διατηρούνται και ανιχνεύονται στο αντίστοιχο ccfDNA. Οι κανονικοποιημένοι δείκτες της συγκέντρωσης του ccfDNA ανά κυτταρικό πληθυσμό μειώθηκαν με τον χρόνο της καλλιέργειας αλλά αυξήθηκαν στατιστικώς σημαντικά έπειτα από έκθεση των κυττάρων στην IC50 δόση του αποπτωτικού/απομεθυλιωτικού παράγοντα 5-AZA-CR. Η κατανομή των θραυσμάτων του ccfDNA ήταν αντιπροσωπευτική της ενεργής απελευθέρωσης, ενώ η έκθεση στην 5-AZA-CR προκάλεσε την παραγωγή θραυσμάτων αντιπροσωπευτικών της απόπτωσης. Τέλος, η κατάσταση μεθυλίωσης των γονιδίων SOX17, WNT5A, MSH2, KLK10 και GATA3 η οποία εκτιμήθηκε με qMSP στο ccfDNA πριν και μετά την έκθεση στην 5-AZACR ήταν ταυτόσημη με το αντίστοιχο gDNA των κυττάρων. Στον καρκίνο του μαστού μελετήσαμε την προγνωστική και προβλεπτική δυναμική παραμέτρων του ccfDNA. Η ομάδες αποτελούνταν από 150 και 16 ασθενείς με καρκίνο του μαστού, υπό επικουρική και προ-εγχειρητική θεραπεία αντιστοίχως, 34 ασθενείς με μεταστατική νόσο και 35 υγιείς εθελοντές. Η απευθείας ποσοτικοποίηση του ccfDNA στο πλάσμα υπέδειξε αυξημένη συγκέντρωση η οποία συσχετίστηκε με τη συχνότητα των θανάτων, το βραχύτερο PFS και την απουσία ανταπόκρισης στη φαρμακοθεραπεία στην ομάδα των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο. Επιπλέον, ο μεγαλύτερος αριθμός θραυσμάτων του ccfDNA σχετίστηκε με τα αυξημένα επίπεδα ccfDNA, το μέγεθος του όγκου και τη συχνότητα των θανάτων. Η κατάσταση μεθυλίωσης των εξεταζόμενων γονιδίων SOX17, MSH2, KLK10, WNT5A εκτός του GATA3, ανιχνεύτηκε συχνότερα θετική στο ccfDNA σε όλες τις ομάδες ασθενών από ότι στα υγιή άτομα. Η μεθυλίωση του WNT5A συσχετίστηκε στατιστικώς σημαντικά με το μεγαλύτερο μέγεθος του όγκου και στον προχωρημένου σταδίου καρκίνο με τη βραχύτερη επιβίωση. Στην ομάδα των μεταστατικών ασθενών, η μεθυλίωση του SOX17 συσχετίστηκε σημαντικά με την συχνότητα των θανάτων, το βραχύτερο PFS και OS. Η μεθυλίωση του KLK10 συσχετίστηκε σημαντικά με τα δυσμενή κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά και την υποτροπή, ενώ στην ομάδα των ασθενών που ακολούθησαν επικουρική θεραπεία συσχετίστηκε με το βραχύτερο DFI. Η μεθυλίωση τουλάχιστον 3 ή 4 γονιδίων συσχετίστηκε σημαντικά με βραχύτερη OS και απουσία ανταπόκρισης στη φαρμακοθεραπεία αντίστοιχα. Η ανάλυση ταξινόμησης με ένα πλήρως αυτοματοποιημένο λογισμικό μηχανικής μάθησης παρήγαγε ένα μονοπαραγοντικό γραμμικό μοντέλο για την συγκέντρωση του ccfDNA στο πλάσμα με μεγάλη διακριτική ισχύ για την πρόβλεψη ανταπόκρισης στη φαρμακοθεραπεία (AUC 0,803, 95% CI [0,606, 1,000]) στην ομάδα των μεταστατικών ασθενών. Δύο επιπλέον πολυπαραγοντικές υπογραφές προγνωστικής και προβλεπτικής σημασίας παρήχθησαν για την ομάδα των μεταστατικών ασθενών. Τέλος, κατασκευάστηκε ένα μοντέλο πολλαπλής λογιστικής παλινδρόμησης που διέκρινε τους ασθενείς από τους υγιείς. Τα σημαντικότερα ευρήματα της μελέτης μας συνοψίζονται ως εξής:  Η μεθυλίωση των υποκινητών BRMS1 και WNT5A σχετίζεται με την μόλυνση από τα στελέχη HRHPV και τα ιστολογικά ευρήματα στον τράχηλο της μήτρας. Η παρεκκλίνουσα έκφραση της πρωτεΐνης του BRMS1 σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας και η έκφρασή της χάνεται στης χαμηλής διαφοροποίησης καρκινικές βλάστες, ενώ ο μηχανισμός της μεθυλίωσης ίσως να ρυθμίζει την έκφραση του BRMS1.  Τα ευρήματά από την in vitro μελέτη υποδεικνύουν ότι το ccfDNA μπορεί να αποτελέσει μια αξιόπιστη πηγή βιολογικού υλικού με κλινική σημασία και θα μπορούσε να μελετηθεί περαιτέρω στα καρκινικά μοντέλα καλλιέργειας των MCF-7 και HeLa κυττάρων.  Στον καρκίνο του μαστού, το ccfDNA προέκυψε ως ένας εξαιρετικά ισχυρός ταξινομητής πρόβλεψης στον μεταστατικό καρκίνο του μαστού. Έπειτα από προοπτική κλινική αξιολόγηση, όλοι οι παραγόμενοι ταξινομητές πιθανόν να βοηθήσουν στην ακριβή πρόγνωση και πρόβλεψη. Συνολικά, η μελέτη μας εμπλουτίζει σημαντικά τη γνώση σχετικά με τη βιολογία του ccfDNA στον καρκίνο και αποδεικνύει ότι αποτελεί πολύτιμη πηγή βιολογικού υλικού υγρής βιοψίας. Θεωρούμε ότι ειδικά μοτίβα μεθυλίωσης όπως ανιχνεύονται είτε στο τραχηλικό επίχρισμα είτε στο ccfDNA μπορεί να αποτελούν ελάχιστα επεμβατικούς επιγενετικούς/φαρμακοεπιγενετικούς βιοδείκτες, που θα συνδράμουν στην κλινική διαχείριση των υπό μελέτη νεοπλασιών.   DNA methylation is the most widely studied epigenetic mechanism. During this process, a methyl group is added to the cytosine ring within CpG dinucleotides located in the promoter region resulting in gene silencing. In cancer, aberrant methylation is usually observed in tumor suppressor and metastasis suppressor gene promoters, resulting in loss of their protective role. It has been demonstrated that the abnormal methylation patterns of DNA found in tumors can also be detected in biomaterials of liquid biopsy of patients and can be therefore be evaluated as a minimally invasive biomarkers of clinical value. CcfDNA can be easily isolated from biological fluids such as plasma or serum. In cancer its amount is increased and it is believed to reflect its molecular identity. Numerous studies have been contacted in order to identify and validate DNA methylation signatures on ccfDNA. However, few tests based on its DNA methylation analysis are FDA approved and clinically available. In addition, there are controversial findings regarding structure and integrity of ccfDNA and how these characteristics could be used to extract clinically relevant information. In order to detect and evaluate minimally invasive biomarkers, we studied gene specific DNA methylation patterns in two of the most important pathological entities of the female population, cervical and breast cancer. Our study was implemented in three distinct parts. In uterine cervix, it has been proved that HRHPV infection can cause the aberrant DNA methylation. In the present study, we assessed DNA methylation of the cancer-related genes BRMS1 and WNT5A in cervical smears of 64 women with no infection by HRHPV, 70 women with proven HRHPV infection and in cervical tissue biopsies using qMSP. Another objective was the analysis of BRMS1 protein expression by immunohistochemistry in cervical tissue biopsies and its correlation with gene methylation status. Methylation of BRMS1 promoter was studied for the first time in uterine cervix and was detected in 37.5% of women with no HRHPV infection and was less frequent in smears with HRHPV (11.4%) and in women with pathological histology (11.9%). On the contrary, methylation of WNT5A promoter was detected more frequently in women with HRHPV infection (22.8%) than in women with no infection (4,7%). Women with pathological histology had more frequently methylated the promoter of WNT5A gene (23.8% vs. 4.2%). Immunohistochemistry revealed nuclear BRMS1 protein staining in normal HRHPV–free cervix, in cervical intraepithelial neoplasia and in malignant tissue, where staining was occasionally also cytoplasmic. In cancer, expression was stronger in the more differentiated cancer blasts and was lost in low differentiated cancer blasts, probably due to DNA methylation. Our results highlight the value of epigenetic biomarkers as additional monitoring tools in clinical management of cervical cancer. In the second part, the study in human cervical and breast cancer cell lines (HeLa and MCF-7 respectively) aimed to analyze important parameters of ccfDNA in vitro in terms of its release kinetics and mechanism. Furthermore, DNA methylation profile analysis aimed to investigate if the epigenetic events of cells were maintained and identified in corresponding ccfDNA. Normalized indexes of ccfDNA per cell population decreased over time of culture but were significantly elevated after exposure to the IC50 doses of 5‐AZA‐CR. Fragment‐size profiling was indicative of active release, whereas exposure to 5‐AZA‐CR induced the release of additional shorter fragments, indicative of apoptosis. Finally, the methylation profile of SOX17, WNT5A, MSH2, KLK10 and GATA3 in ccfDNA was identical to the corresponding gDNA and followed accurately changes caused by 5‐AZA‐CR. In breast cancer, we evaluated the prognostic and predictive potential of ccfDNA related parameters. Groups consisted of 150 and 16 breast cancer patients under adjuvant and neoadjuvant therapy respectively, 34 patients with metastatic disease and 35 healthy volunteers. Direct quantification of ccfDNA in plasma revealed elevated concentrations correlated to the incidence of death, shorter PFS and non-response to pharmacotherapy in patients with metastatic breast cancer. Also, greater number of ccfDNA fragments was associated with elevated levels of ccfDNA, tumor size and incidence of death. The methylation status of studied genes KLK10, SOX17, WNT5A, MSH2 except for GATA3 gene was more frequently methylated in all patient groups than in healthy individuals. The methylation of WNT5A was statistically significantly correlated to greater tumor size and in advanced disease stage with shorter OS. In the metastatic group of patients, SOX17 methylation was significantly correlated to the incidence of death, shorter PFS and OS. KLK10 methylation was significantly correlated to unfavorable clinicopathological characteristics and relapse, whereas in the adjuvant group of patients to shorter DFI. Methylation of at least 3 or 4 genes was significantly correlated to shorter OS and no pharmacotherapy response, respectively. Classification analysis by a fully automated, machine learning software produced a single-parametric linear model using ccfDNA plasma concentration values, with great discriminating power to predict response to chemotherapy (AUC 0.803, 95% CI [0.606, 1.000]) in the metastatic group. Two more multi-parametric signatures were produced for the metastatic group, predicting survival and disease outcome. Finally, a multiple logistic regression model was constructed, discriminating between patient groups and healthy individuals. Our most important conclusions are summarized: BRMS1 and WNT5A promoter methylation possible related to HRHPV infection and histological findings in uterine cervix. Aberrant BRMS1 protein expression is associated to cervical cancer development and its expression is lost in low differentiated cancer blasts, while methylation might regulate its expression. Our findings from the in vitro study support that ccfDNA can be a reliable biosource of clinically relevant information that can be further studied in MCF-7 and HeLa culture models. In breast cancer, ccfDNA emerged as a highly potent predictive classifier in metastatic breast cancer. Upon prospective clinical evaluation, all the classifiers produced could aid accurate prognosis and prediction. Overall, our study greatly enriches knowledge about ccfDNA biology in cancer and reveals its significance as a liquid biopsy biomaterial. We believe that specific methylation patterns as detected in either cervical smears or ccfDNA may be minimally invasive epigenetic /pharmacoepigenetic biomarkers that will assist the clinical management of the studied neoplasms.
Γλώσσα:	Ελληνικά
Τόπος δημοσίευσης:	Αλεξανδρούπολη
Σελίδες:	191
Θεματική κατηγορία:	[EL] Βιοχημεία και Μοριακή βιολογία[EN] Biochemistry and Molecular Biology
Λέξεις-κλειδιά:	Καρκίνος του μαστού; Ελεύθερο κυττάρων κυκλοφορούν DNA; Καρκίνος του τραχήλου; DNA μεθυλίωση; Αλγόριθμοι Μηχανικής Μάθησης
Κάτοχος πνευματικών δικαιωμάτων:	Μαρια Παναγοπουλου Πανταζή
Διατίθεται ανοιχτά στην τοποθεσία:	https://www.didaktorika.gr/eadd/handle/10442/45446
Σημειώσεις:	Το έργο συγχρηματοδοτείται από την Ελλάδα και την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Ανάπτυξη Ανθρώπινου Δυναμικού, Εκπαίδευση και Διά Βίου Μάθηση», στο πλαίσιο της Πράξης «Πρόγραμμα Χορήγησης Υποτροφιών για Μεταπτυχιακές Σπουδές Δευτέρου Κύκλου Σπουδών» (MIS-5003404), που υλοποιεί το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών (ΙΚΥ).
Εμφανίζεται στις συλλογές:	Υποψήφιοι διδάκτορες