1. Αποθετήριο Παραδοτέων Υποτρόφων Δράσεων ΕΣΠΑ Τριτοβάθμιας Εκπαίδευσης 2017-2023
2. Όλο το Αποθετήριο
3. Υποψήφιοι διδάκτορες

Τύπος:	Διδακτορική διατριβή
Τίτλος:	Ανακάλυψη καινοτόμων βιοκαταλυτών μυκητιακής προέλευσης και εφαρμογή τους στη βιοεξυγίανση χλωριωμένων αρωματικών ρύπων
Εναλλακτικός τίτλος:	Discovery of novel fugal biocatalysts and their application in bioremediation of chlorinated aromatic pollutants
Συγγραφέας:	[EL] Νικολαΐβιτς, Ευστράτιος[EN] Nikolaivits, Efstratios E.
Επιβλέπων διατριβής:	[EL] Τόπακας, Ευάγγελος[EN] Topakas, Evangelos
Συμβουλευτική επιτροπή:	[EL] Φωκιαλάκης, Νικόλαος[EN] Fokialakis, Nikolas [EL] Κολίσης, Φραγκίσκος[EN] Kolisis, Fragiskos
Μέλος εξεταστικής επιτροπής:	[EL] Κέκος, Δημήτριος[EN] Kekos, Dimitrios [EL] Δέτση, Αναστασία[EN] Detsi, Anastasia [EL] Χατζηνικολάου, Δημήτριος[EN] Hatzinikolaou, Dimitris [EL] Δημαρόγκωνα, Μαρία[EN] Dimarogona, Maria
Ημερομηνία:	06/12/2019
Περίληψη:	Η παρούσα διδακτορική διατριβή στόχευσε στην ανακάλυψη και τροποποίηση βιοκαταλυτών με εφαρμογή στη βιοεξυγίανση χλωριωμένων αρωματικών ρύπων. Για την επίτευξη του στόχου αυτού ακολουθήθηκαν δύο μέθοδοι. Η μία βασίζεται στην εκμετάλλευση μικροοργανισμών που προέρχονται από ελάχιστα μελετημένα οικοσυστήματα και στη μελέτη των μηχανισμών με τους οποίους αυτοί αποτοξικοποιούν ξενοβιοτικά. Η δεύτερη μέθοδος βασίζεται στην in silico αναζήτηση και ανακάλυψη πρωτεϊνικών αλληλουχιών με πιθανότητα δράσης σε αρωματικούς ρύπους και η τροποποίηση των ενζύμων αυτών με εργαλεία πρωτεϊνικής μηχανικής, για τη βελτίωση των ιδιοτήτων τους. Η έρευνα αυτή εμπίπτει τόσο στο πεδίο της Περιβαλλοντικής Βιοτεχνολογίας και στο πεδίο της Βιοκατάλυσης. Στο πρώτο κομμάτι της διατριβής μελετήθηκε το δυναμικό 104 μυκητιακών στελεχών για τη βιομετατροπή δύο χλωριωμένων αρωματικών ρύπων, της 2,4-διχλωροφαινόλης (2,4-DCP) και του 2,4,5-τριχλωροδιφαινυλίου (PCB29). Οι μύκητες αυτοί είχαν απομονωθεί ως συμβιώτες θαλάσσιων ασπόνδυλων, τα οποία είχαν συλλεχθεί από διαφορετικές περιοχές του κόσμου και διαφορετικά βάθη. Από τα στελέχη αυτά, 9 έδειξαν υψηλή δυνατότητα απομάκρυνσης 1 mM 2,4-DCP, σε ποσοστά υψηλότερα του 55%. Τα στελέχη αυτά ανήκαν στα γένη Penicillium, Aspergillus, Chrysosporium, Cladosporium και Tritirachium. Η ανάλυση μεταβολιτών των στελεχών αυτών αποκάλυψε πολλούς μεταβολίτες, κάποιοι εκ των οποίων αναφέρονται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία, όπως τα συζεύγματα της 2,4-DCP με γλουταμίνη και κυστεΐνη, καθώς επίσης και ο παλμιτικός εστέρας της διχλωροκατεχόλης και η θειωμένη χλωροφαινόλη. Σε κάθε περίπτωση όλοι οι μεταβολίτες ήταν λιγότερο τοξικοί από την αρχική ένωση. Τα περισσότερα στελέχη μπόρεσαν να αποχλωριώσουν μερικώς ή πλήρως το ρύπο παράγοντας υδροξυκινόλη. Μάλιστα, το στέλεχος Tritirachium είχε τη δυνατότητα να πραγματοποιεί διάνοιξη του βενζολικoύ δακτυλίου, με την έκφραση ενός ενζύμου με δράση 1,2-διοξυγενάσης της κατεχόλης (C12O), παράγοντας υδροξυ-μουκονικό οξύ, αφομοιώνοντας πρακτικά το ρύπο. Το ένζυμο με ενεργότητα C12O απομονώθηκε από το εξωκυτταρικό υγρό του μύκητα και χαρακτηρίστηκε βιοχημικά, παρουσιάζοντας πολύ ενδιαφέροντα χαρακτηριστικά. Κατά την πρωτεομική ανάλυση, αποκαλύφθηκε ότι το ένζυμο αυτό είναι στην πραγματικότητα καταλάση με δράση C12O. Η διπλή αυτή καταλυτική δράση αναφέρεται για πρώτη φορά στη παγκόσμια βιβλιογραφία. Επίσης, ως C12O, το ένζυμο αυτό μπορούσε να διασπάσει και την 4-χλωροκατεχόλη εκτός από την κατεχόλη και την υδροξυκινόλη, γεγονός που το κάνει πολύ ελκυστικό σε εφαρμογές βιοεξυγίανσης. Στη συνέχεια της έρευνας αναφορικά με τους θαλάσσια προερχόμενους μύκητες, μελετήθηκε η δυνατότητά τους να απομακρύνουν το PCB29 σε διαλύματα κορεσμένα με το ρύπο. Από τα 104 στελέχη, 8 κατάφεραν να απομακρύνουν το ρύπο σχεδόν εξολοκλήρου (>98.5%), τα οποία ανήκαν στα γένη Penicillium, Aspergillus, Purpureocillium, Cladosporium και Alternaria. Κατά τη διαδικασία απομάκρυνσης του ρύπου, κανένα από τα μελετούμενα στελέχη δεν εξέφραζε ενεργότητες διοξυγενασών του 2,3-διυδροξυ-διφαινυλίου, διοξυγενασών της κατεχόλης ή αφαλογoνάσης των αλκανίων. Ένα, όμως, στέλεχος Cladosporium εξέφραζε ενεργότητα λακκάσης σε επίπεδα πολύ υψηλότερα από τα υπόλοιπα στελέχη. Από το εξωκυτταρικό υγρό του στελέχους αυτού, πραγματοποιήθηκε απομόνωση δύο ισοενζύμων λακκάσης, ύστερα από καλλιέργεια σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου 12 L. Τα ένζυμα αυτά παρουσίασαν παρόμοια βιοχημικά χαρακτηριστικά, αναφορικά με τις βέλτιστες συνθήκες δράσης τους και το εύρος των υποστρωμάτων που μπορούν να οξειδώσουν. Το ένα από τα δύο όμως παρουσίασε τη δυνατότητα απομάκρυνσης του PCB29 σε ποσοστό 71% σε αντιδράσεις παρουσία μεσολαβητή. Στο δεύτερο τμήμα της διατριβής πραγματοποιήθηκε η in silico ανακάλυψη, κλωνοποίηση και έκφραση ενός γονιδίου πολυφαινολοξειδάσης (PPO) από τoν μύκητα Thermothelomyces thermophila στο ετερόλογο σύστημα Pichia pastoris. Ύστερα από εκτενή βιοχημικό χαρακτηρισμό του απομονωμένου ενζύμου, δοκιμάστηκε η χρήση του στην απομάκρυνση διαφόρων μονο- και δι-χλωροφαινολών. Με στόχο τόσο τη μελέτη της επίδρασης συγκεκριμένων αμινοξέων στην στερεοεκλεκτικότητα του ενζύμου, όσο και την αύξηση της καταλυτικής του ενεργότητας σε διχλωροφαινόλες, πραγματοποιήθηκε η τροποποίησή του με σημειακές μεταλλάξεις. Από τα πέντε τροποποιημένα ένζυμα που κατασκευάστηκαν, στο ένα η ενεργότητα στην οξείδωση της 3,5-DCP πενταπλασιάστηκε με μόνο δύο μεταλλάξεις. The present thesis aimed to the discovery and modification of biocatalysts to be applied in the bioremediation of chlorinated aromatic pollutants. Two methods were followed in order to achieve this objective. One is based on the exploitation of microorganisms from poorly studied ecosystems and the study of the mechanisms by which they detoxify xenobiotics. The second method is based on the in silico search and discovery of protein sequences with potential activity on aromatic pollutants and modification of these enzymes by protein engineering tools in order to improve their properties. This research falls into both fields of Environmental Biotechnology and Biocatalysis. In the first part of the thesis, the potential of 104 fungal strains for the biotransformation of two chlorinated aromatic pollutants, namely 2,4-dichlorophenol (2,4-DCP) and 2,4,5-trichlorodiphenyl (PCB29) was studied. These fungi were isolated as symbionts of marine invertebrates, which were collected from different regions of the world and at different depths. Nine of these strains showed high potential for the removal of 1 mM 2,4-DCP at yields above 55%. These strains belonged to the genera Penicillium, Aspergillus, Chrysosporium, Cladosporium and Tritirachium. Metabolite analysis of these strains revealed many compounds, some of which are reported for the first time in the literature, such as the conjugates of 2,4-DCP with glutamine and cysteine, as well as dichlorocatechol palmitate and sulfated chlorophenol. In every case, metabolites were less toxic than the original compound. Most strains were able to partially or completely dechlorinate the pollutant leading to hydroxyquinol. Furthermore, Tritirachium strain was able to cleave the benzene ring by expressing an enzyme with catechol 1,2-dioxygenase (C12O) activity, producing 2-hydroxy-muconic acid, effectively assimilating the pollutant. The enzyme with C12O activity that was isolated from the extracellular culture medium of Tritirachium sp., was biochemically characterized, presenting very interesting features. Upon proteomic analysis, it was revealed that this enzyme is in fact a catalase with C12O activity. This is the first time in the literature that such double catalytic action is mentioned. Additionally, as a C12O, this enzyme could cleave 4-chlorocatechol in addition to catechol and hydroxyquinol, which makes it very attractive in bioremediation applications. The isolated marine-derived fungi were further investigated regarding their ability to remove PCB29 in solutions saturated with the pollutant. Out of the 104 strains tested, 8 were able to remove the pollutant almost entirely (>98.5%) and belonged to the genera Penicillium, Aspergillus, Purpureocillium, Cladosporium and Alternaria. During the removal of PCB29 the studied strains did not express dihydroxyphenyl 2,3-dioxygenase, catechol dioxygenase or alkane dehalogenase activities. However, one Cladosporium strain expressed laccase activity at much higher levels than the rest of the strains. Two laccase isozymes were isolated from the extracellular liquid of this strain after cultivation in a 12-L batch bioreactor. These enzymes exhibited similar biochemical characteristics, in terms of their optimum activity conditions and substrate scope. One of the two, however, showed the ability of PCB29 removal by 71% in the presence of a mediator. In the second part of the thesis, the in silico discovery, cloning and expression of a polyphenoloxidase (PPO) gene from the fungus Thermothelomyces thermophila in Pichia pastoris heterologous expression system was performed. After extensive biochemical characterization of the isolated enzyme, its use in the removal of various mono- and dichlorophenols was tested. In order to study both the effect of specific amino acid residues on the enzyme's stereoselectivity and to increase its catalytic activity in dichlorophenols, its modification was performed by point mutations. Of the five variants that were constructed, one showed 5fold increase of oxidation activity on 3,5-DCP, with only two point mutations.
Γλώσσα:	Ελληνικά
Τόπος δημοσίευσης:	Αθήνα
Σελίδες:	228
Θεματική κατηγορία:	[EL] Βιομηχανική Βιοτεχνολογία[EN] Industrial Biotechnology [EL] Περιβαλλοντική Βιοτεχνολογία[EN] Environmental Biotechnology
Λέξεις-κλειδιά:	Βιοεξυγίανση; 2,4-διχλωρο-φαινόλη; 2,4,5-τριχλωροδιφαινύλιο; Διοξυγενάσες; Πολυφαινολοξειδάση; Λακκάση; Μεταβολίτες; Θαλάσσιοι μύκητες; Πρωτεϊνική μηχανική; Χλωροφαινόλες; Πολυχλωριωμένα διφαινύλια; Bioremediation; 2,4-dichlorophenol; 2,4,5-trichlorobiphenyl; Polychlorinated biphenyls; Chlorophenols; Protein engineering; Metabolite identification; Dioxygenase; Laccase; Polyphenoloxidase
Κάτοχος πνευματικών δικαιωμάτων:	© Ευστράτιος Νικολάιβιτς
Διατίθεται ανοιχτά στην τοποθεσία:	https://www.didaktorika.gr/eadd/handle/10442/46764
Σημειώσεις:	Το έργο συγχρηματοδοτείται από την Ελλάδα και την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Ανάπτυξη Ανθρώπινου Δυναμικού, Εκπαίδευση και Διά Βίου Μάθηση», στο πλαίσιο της Πράξης «Ενίσχυση του ανθρώπινου ερευνητικού δυναμικού μέσω της υλοποίησης διδακτορικής έρευνας» (MIS-5000432), που υλοποιεί το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών (ΙΚΥ).
Εμφανίζεται στις συλλογές:	Υποψήφιοι διδάκτορες