1. Αποθετήριο Παραδοτέων Υποτρόφων Δράσεων ΕΣΠΑ Τριτοβάθμιας Εκπαίδευσης 2017-2023
2. Όλο το Αποθετήριο
3. Υποψήφιοι διδάκτορες

Τύπος:	Διδακτορική διατριβή
Τίτλος:	Αξιολόγηση νέων αναστολέων του ιού της Ηπατίτιδας C και συγγενικών ιών, καθώς και βιοδεικτών απόκρισης σε θεραπευτικές προσεγγίσεις
Συγγραφέας:	[EL] Φρακολάκη, Ευσέβεια[EN] Frakolaki, Efseveia E.
Επιβλέπων διατριβής:	[EL] Παππά, Αικατερίνη-Μαρία[EN] Pappas, Katherine-Maria
Συμβουλευτική επιτροπή:	[EL] Βασιλάκη, Νίκη[EN] Vassilaki, Niki [EL] Μαυρομαρά, Πηνελόπη[EN] Mavromara, Penelope
Μέλος εξεταστικής επιτροπής:	[EL] Μαράκος, Παναγιώτης[EN] Marakos, Panagiotis [EL] Μπολέτη, Χαραλαμπία[EN] Boleti, Haralabia [EL] Βασιλακοπούλου, Διδώ[EN] Vassilacopoulou, Dido [EL] Λάμνησου, Κλεονίκη[EN] Lamnissou, Kleoniki
Ημερομηνία:	2019
Περίληψη:	Η μόλυνση με τον ιό της Ηπατίτιδας C (Hepatitis C virus - HCV) είναι ένα μείζον πρόβλημα υγείας. Αν και τα τελευταία χρόνια έχουν ανακαλυφθεί αποτελεσματικές θεραπείες, παραμένουν ακόμη προβλήματα, όπως το υψηλό κόστος θεραπείας, η εμφάνιση ανθεκτικών ιικών στελεχών και η μη εξάλειψη του κινδύνου ηπατοκυτταρικού καρκίνου. Επιπλέον, στις περιοχές με τη μεγαλύτερη εξάπλωση του HCV (Αφρική και Ασία) είναι συχνό το φαινόμενο των συμμολύνσεων με άλλους ιούς σημαντικούς για την ανθρώπινη υγεία, όπως είναι ο ιός της Ηπατίτιδας Β (Hepatitis B virus - HBV), και οι συγγενικοί στον HCV ιοί Δάγκειος (Dengue virus - DENV), Κίτρινου πυρετού (Yellow Fever virus - YFV) και Ζίκα (Zika virus - ZIKV). Ακόμη, παρά την εκτεταμένη έρευνα, οι κυτταρικοί μηχανισμοί που ρυθμίζουν την ιική αντιγραφή δεν είναι πλήρως κατανοητοί, ακόμα και στην περίπτωση του αρκετά μελετημένου HCV. Με βάση τις παραπάνω ανάγκες, στα πλαίσια της εργασίας αυτής α) ελέγχθηκαν νέοι αναστολείς φυσικής και συνθετικής προέλευσης έναντι ιών της οικογένειας Flaviviridae (HCV, DENV, YFV, ZIKV) και μελετήθηκε ο μοριακός μηχανισμός δράσης επιλεγμένων ομάδων ενώσεων, και β) μελετήθηκε η σημασία κυτταρικών παραγόντων στην ιική αντιγραφή και παθογένεια για την ανάδειξη νέων βιοδεικτών και θεραπευτικών στόχων έναντι των ιών Flaviviridae, εστιάζοντας στα σηματοδοτικά μονοπάτια της υποξίας, της φωσφοϊνοσιτιδικής 3-κινάσης (phosphatidylinositol 3-kinase - PI3K)/ΑΚΤ και σε έναν παράγοντα που εντοπίσαμε να προσδένεται στην PI3K, την αποκαρβοξυλάση της L-Dopa (DDC). Όσον αφορά τον πρώτο στόχο, ελέγχθηκαν έναντι ενός ή περισσότερων μελών της οικογένειας Flaviviridae: 1) οργανικά εκχυλίσματα και απομονωμένες ενώσεις από είδη της Ελληνικής και Μεσογειακής χλωρίδας, 2) νουκλεοσιδικά και πεπτιδομιμητικά συνθετικά ανάλογα, βασισμένα σε εγκεκριμένα φάρμακα έναντι των μη δομικών πρωτεϊνών NS5B και NS5A του HCV, και 3) συνθετικά ανάλογα Ν-υδροξυϊμιδίου και ακετοϋδροξαμικού οξέος, με χηλική δράση έναντι ιικών ενζύμων με δισθενή μεταλλικά ιόντα στο ενεργό κέντρο τους. Δραστικές ενώσεις βρέθηκαν σε όλες τις ομάδες που ελέγχθηκαν. Συγκεκριμένα, βρέθηκαν φυτικές ενώσες με ευρεία δράση έναντι των HCV, DENV και YFV, καθώς και ενώσεις με υψηλή δράση, όπως το φλαβονοειδές 2’-υδροξυγενιστεΐνη-7-O-γλυκοπυρανοσίδιο, με μέση δραστική συγκέντρωση (EC50) 6,38 μΜ έναντι της συγκρότησης του DENV. Από τα νουκλεοσιδικά ανάλογα, το 15d βρέθηκε να αναστέλλει τον HCV (EC50 40,22 μΜ στο γονότυπο 1b), με υψηλό φραγμό στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας, καθώς παρουσίασε πολύ μικρή μείωση της δράσης του (~2 φορές) ύστερα από συνεχή ανακαλλιέργεια των κυττάρων που φέρουν τις ιικές αλληλουχίες παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων του αναστολέα. Το πρότυπο των μεταλλαγών ανθεκτικότητας, όπως προσδιορίστηκε με αλληλούχιση επόμενης γενιάς (Next Generation Sequencing - NGS) υποδεικνύει πως το 15d πιθανόν δρα αναστέλλοντας αλληλεπιδράσεις της NS5A με άλλες πρωτεΐνες. Από τα πεπτιδομιμητικά ανάλογα, που αποτελούν τροποποιημένες μορφές αναστολέων της NS5A, τo ανάλογο 3, με EC50 1,2 pΜ έναντι του HCV γονοτύπου 1b, βρέθηκε να είναι δραστικότερο από το ήδη εγκεκριμένο Daclatasvir (EC50 26,6 pΜ) και να παρουσιάζει υψηλότερο φραγμό στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας. Επιπλέον, από τα ανάλογα με χηλική δράση, τo Ν-υδροξυμίδιo ZF66 είχε EC50 3,08 μΜ έναντι του HCV γονοτύπου 1b, παρουσιάζοντας ταυτόχρονα υψηλό φραγμό στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας, με μείωση της δράσης του μόνο κατά ~3 φορές. Το προφίλ των μεταλλαγών ανθεκτικότητας έδειξε ότι προσδένεται στην NS5B πολυμεράση, πιθανά μέσω χηλικής δέσμευσης των ιόντων Mg2+ στο ενεργό της κέντρο. Τέλος, τα ακετοϋδροξαμικά ανάλογα, ειδικά αυτά που φέρουν ως υποκαταστάτη ομάδα αδαμαντάνης, έχουν ευρεία δράση έναντι όλων των ιών που ελέγχθηκαν (HCV, DENV, YFV, ZIKV), με το ανάλογο ΖΒ5 να είναι το δραστικότερο έναντι του HCV 1b (EC50 0,08 μΜ), και το ΖΡ64 έναντι των DENV (EC50 0,07 μΜ), YFV (EC50 2,76 μΜ) και ZIKV (EC50 0,44 μΜ). Και αυτά τα ανάλογα παρουσιάζουν υψηλό φραγμό στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας, ενώ στο μηχανισμό δράσης τους φαίνεται να εμπλέκεται η ιική πρωτεΐνη NS3, καθώς οι μεταλλαγές ανθεκτικότητας που βρίσκονται σε αυτή μειώνουν τη απόδοση του αναστολέα. Όσον αφορά τον δεύτερο στόχο, αρχικά μελετήθηκε η επίδραση της υποξίας (3% v/v Ο2) στην ιική αντιγραφή και την απόδοση αναστολέων. Σε προηγούμενη μελέτη του εργαστηρίου είχε δειχθεί πως το 3% Ο2, η μέση τάση οξυγόνου στο ήπαρ, επάγει την RNA αντιγραφή του HCV, σε σχέση με το ατμοσφαιρικό οξυγόνο, με τρόπο εξαρτώμενο από το μονοπάτι ΑΚΤ/αναερόβιας γλυκόλυσης. Στην παρούσα μελέτη, δείχθηκε πως η υποξία αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των DENV και YFV, γεγονός που υποδεικνύει πως η επίδραση της υποξίας είναι συντηρημένη στην οικογένεια Flaviviridae. Επιπλέον, δείχθηκε πως στη συνθηκη αυτή μειώνεται η δράση ειδικών αναστολέων των HCV και DENV. Μελετώντας περαιτέρω τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση ιικής αντιγραφής και σηματοδότησης από την υποξία, στην περίπτωση του HCV ανιχνεύτηκαν miRNAs η έκφραση των οποίων διαφοροποιείται στο ατμοσφαιρικό οξυγόνο σε σχέση με την υποξία. Στην περίπτωση του DENV, δείχθηκε πως η υποξία αυξάνει επιλεκτικά την RNA αντιγραφή του ιού, και όχι την είσοδο των ιικών σωματιδίων ή την ιική μετάφραση. Στην επαγωγή αυτή εμπλέκονται παράγοντες που είναι γνωστό πως ενεργοποιούνται στο χαμηλό οξυγόνο και συγκεκριμένα o παράγοντας που επάγεται από την υποξία (ΗΙF - hypoxia inducible factor) και η κινάση AKT, αλλά όχι η PI3K, η οποία ενεργοποιεί την ΑΚΤ. Αντίστροφα, ο DENV επάγει τον HIF ακόμα και υπό ατμοσφαιρικό οξυγόνο, προκαλώντας έναν μεταβολικό επαναπρογραμματισμό στο κύτταρο-ξενιστή, που ευνοεί τον ιικό πολλαπλασιασμό. Επιπλέον, η μόλυνση από DENV και HCV, καθώς και η τάση οξυγόνου, επηρεάζουν αρνητικά την έκφραση της αποκαρβοξυλάσης της L-Dopa (DDC), μιας πρωτεΐνης του μονοπατιού βιοσύνθεσης κατεχολαμινών (π.χ. ντοπαμίνη), η οποία αλληλεπιδρά άμεσα με την PI3K. Από την άλλη, υπερέκφραση της DDC ή χρήση του ειδικού αναστολέα της, της carbidopa, μειώνει ή αυξάνει, αντίστοιχα, την ιική αντιγραφή και παραγωγή ιικών σωματιδίων. Αντίστροφη σχέση μεταξύ των επιπέδων της αντιγραφής του HCV και του mRNA της DDC βρέθηκε επίσης σε ηπατικές βιοψίες ασθενών με χρόνια μόλυνση από HCV, τονίζοντας έτσι τη σημασία αυτού του βιολογικού φαινομένου. Συνολικά, στα πλαίσια της εργασίας αυτής, βρέθηκαν αναστολείς με ευρεία δράση έναντι των ιών της οικογένειας Flaviviridae, που θα μπορούσαν στη συνέχεια να αξιοποιηθούν ως φάρμακα για την αντιμετώπιση των ιών αυτών, καθώς και έναντι συλλοιμώξεων ή αναδυόμενων ιών. Επιπλέον, βρέθηκαν παράγοντες που ρυθμίζονται από τα σηματοδοτικά μονοπάτια της υποξίας και του PI3K/AKT και παίζουν σημαντικό ρόλο στην αντιγραφή των ιών Flaviviridae, όπως ο HIF στην περίπτωση του DENV και η DDC στην περίπτωση των HCV και DENV, οι οποίοι θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως πιθανοί αντι-ιικοί στόχοι, ή βιοδείκτες της εξέλιξης της νόσου. Hepatitis C virus (HCV) infection is a major health problem. Although effective treatments have been discovered over the last few years, problems still exist, such as high treatment costs, the emergence of resistant viral strains, and the risk of hepatocellular cancer even after virus clearance. In addition, in the areas with the highest prevalence of the virus (Africa and Asia), HCV frequently occurs in co-infection with other viruses important for human health, such as Hepatitis B Virus (HBV) and the related to HCV Dengue virus (DENV), Yellow Fever virus (YFV) and Zika virus (ZIKV). Moreover, despite the extensive research, the cellular mechanisms that regulate viral replication are not fully understood, even in the case of the well-studied HCV. Based on the above mentioned needs, in this study a) new inhibitors of natural and synthetic origin were tested against viruses of the Flaviviridae family (HCV, DENV, YFV, ZIKV) and the molecular mechanisms of action of selected groups of compounds were studied, and b) the role of cellular factors in viral replication and pathogenesis was investigated, to highlight new biomarkers and therapeutic targets against Flaviviridae viruses, by focusing on the signaling pathways of hypoxia, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/AKT and a PI3K-binding factor, L-Dopa decarboxylase (DDC). Concerning the first objective, the following inhibitors were tested against one or more members of Flaviviridae family: 1) organic extracts and isolated compounds from species of Greek and Mediterranean flora, 2) nucleoside and peptidomimetic synthetic analogues based on approved drugs targeting the HCV non-structural proteins NS5B and NS5A, and 3) synthetic analogues of N-hydroxyimide and acetohydroxamic acid, with chelating activity against viral enzymes containing divalent metal ions in their active site. Active compounds were detected in all groups tested. Specifically, we found compounds with a broad activity against HCV, DENV and YFV, as well as highly active compounds, such as the flavonoid 2'-hydroxygensitein-7-O-glucopyranoside, with median effective concentration (EC50) 6.38 μM against DENV assembly. Among nucleoside analogs, 15d was found to inhibit HCV (EC50 40.22 μM against genotype 1b), with high barrier to resistance, as it showed very small reduction of its activity (~2 fold) after continuous passage of the cells carrying viral sequences in the presence of increasing concentrations of the inhibitor. The resistance mutation profile analyzed by Next Generation Sequencing (NGS) suggests that 15d possibly inhibits the interaction of NS5A with other proteins. Concerning the peptidomimetic analogues, which are modified inhibitors of NS5A, compound 3, with an EC50 of 1.2 pM against HCV genotype 1b, was found as more potent than the already approved Daclatasvir (EC50 26.6 pM) and exhibited a higher barrier to resistance. In addition, among the chelating analogs, N-hydroxyimide ZF66 had an EC50 of 3.08 μM against HCV genotype 1b, while exhibiting a high barrier to the development of resistance, with only a ~3-fold reduction in activity. The resistance mutation profile suggests that ZF66 binds to the NS5B polymerase, possibly via chelation of the Mg2+ ions in the active site. Finally, acetohydroxamic acid analogues, especially those bearing an adamantane group as a substituent, have broad activity against all viruses tested (HCV, DENV, YFV, ZIKV), with compound ZB5 being the most active against HCV 1b (EC50 0.08 μM), and compound ZF64 against DENV (EC50 0.07 μM), YFV (EC50 2.76 μM) and ZIKV (EC50 0.44 μM). These compounds also showed a high barrier to resistance, while their mechanism of action appears to involve the viral NS3 protein, as the resistance mutations detected in NS3 reduce the efficiency of the inhibitor. Concerning the second objective, the effect of hypoxia (3% v/v O2) on viral replication and inhibitor activity was investigated. In a previous study from our group it was shown that 3% O2, the median oxygen tension in the liver, induces HCV RNA replication, as compared to atmospheric oxygen, in an AKT/anaerobic glycolysis pathway-dependent way. In the present study, hypoxia was shown to increase the propagation of DENV and YFV, indicating that the effect of hypoxia is conserved in the Flaviviridae family. In addition, it was shown that this condition reduces the activity of HCV and DENV specific inhibitors. Further studying the mechanisms involved in the interaction of viral replication and hypoxia signaling, in the case of HCV, miRNAs whose expression differs in atmospheric oxygen relative to hypoxia were detected. In the case of DENV, it was shown that hypoxia selectively increases viral RNA replication, but not viral entry or translation. This induction involves factors known to be activated under low oxygen, specifically hypoxia inducible factor (HIF) and AKT kinase, but not PI3K, which activates AKT. Inversely, DENV induces HIF even under atmospheric oxygen, causing a metabolic reprogramming in the host cell that favors viral proliferation. In addition, DENV and HCV infection as well as oxygen tension, negatively affect the expression of L-Dopa decarboxylase (DDC), a protein of the catecholamine biosynthesis pathway (e.g. dopamine), which directly interacts with PI3K . On the other hand, overexpression of DDC or its specific inhibitor, carbidopa, decreases or increases, respectively, viral replication and particle production. An inverse correlation between the levels of HCV replication and DDC mRNA was also found in liver biopsies from patients with chronic HCV infection, thus highlighting the significance of this biological phenomenon. Overall, in this study, broadly effective inhibitors targeting Flaviviridae viruses were detected, which could be subsequently developed as drugs against these viruses as well as against co-infections or emerging viruses. In addition, factors regulated by the signaling pathways of hypoxia and PI3K/AKT were found to play an important role in the replication of Flaviviridae viruses, such as HIF in the case of DENV and DDC in the case of HCV and DENV, which could be used as potential antiviral targets, or biomarkers of disease progression.
Γλώσσα:	Ελληνικά
Τόπος δημοσίευσης:	Αθήνα, Ελλάδα
Σελίδες:	316
Θεματική κατηγορία:	[EL] Ιολογία[EN] Virology
Κάτοχος πνευματικών δικαιωμάτων:	© Ευσεβεία Φρακολάκη
Όροι και προϋποθέσεις δικαιωμάτων:	H διατριβή περιλαμβάνει και αδημοσίευτα αποτελέσματα, συνεπώς το περιεχόμενο δεν μπορεί να εμφανίζεται δημόσια.
Διατίθεται ανοιχτά στην τοποθεσία:	https://www.didaktorika.gr/eadd/handle/10442/46119
Σημειώσεις:	Το έργο συγχρηματοδοτείται από την Ελλάδα και την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Ανάπτυξη Ανθρώπινου Δυναμικού, Εκπαίδευση και Διά Βίου Μάθηση», στο πλαίσιο της Πράξης «Πρόγραμμα Χορήγησης Υποτροφιών για Μεταπτυχιακές Σπουδές Δευτέρου Κύκλου Σπουδών» (MIS-5003404), που υλοποιεί το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών (ΙΚΥ).
Εμφανίζεται στις συλλογές:	Υποψήφιοι διδάκτορες